PCR için doğru bağlanma sıcaklığı
PCR’ın başarısı büyük ölçüde primerlerin hedef diziye doğru sıcaklıkta bağlanmasına bağlıdır. Primer Tm hesaplama aracı 5′→3′ yönünde yazdığın primer dizisinin erime sıcaklığını iki yöntemle tahmin eder. Ayrıca GC içeriğini, uzunluğu, molekül ağırlığını ve 3′ ucundaki GC kıskacının uygun olup olmadığını gösterir. Na⁺ ve primer derişimini girerek reaksiyon koşullarını hesaba katabilirsin.
Birinci yöntem en yakın komşu modelidir: yan yana duran baz çiftlerinin entalpi ve entropi katkıları SantaLucia (1998) parametreleriyle toplanır ve tuz düzeltmesi uygulanır. İkinci yöntem basit formüldür: 14 bazdan kısa primerlerde Tm = 2 × (A+T) + 4 × (G+C), daha uzunlarda Tm = 64,9 + 41 × (GC − 16,4) / N.
Örnek: ATGCGTACGTTAGCCTAGGA dizisi 20 baz uzunluğundadır ve 10 G/C içerir, yani GC oranı %50’dir. Basit formülle Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 20 ≈ 51,8 °C bulunur. En yakın komşu yöntemi 50 mM Na⁺ ve 250 nM primer koşulunda yaklaşık 54,7 °C verir. Son beş bazda iki G/C bulunduğu için 3′ ucu uygundur.
İyi bir primer için genel öneriler:
- 18–25 baz uzunluk ve %40–60 GC oranı
- İleri ve geri primerin Tm değerlerinin birbirine 2–3 °C yakın olması
- 3′ ucunda bir ya da iki G/C, ama art arda çok fazla değil
Bağlanma sıcaklığı genellikle Tm’nin birkaç derece altından başlatılır ve gradyan PCR ile optimize edilir. Hesaplanan Tm bir tahmindir; Mg²⁺, DMSO ve polimeraz tampon koşulları sonucu değiştirir. Diziyi proteine çevirmek için DNA protein çeviriciyi, şablon miktarı için DNA kopya sayısı hesabını, sıcaklık birimi için sıcaklık dönüştürücüyü kullanabilirsin.