280 nm okumasıyla protein derişimi
Proteinler, içerdikleri triptofan ve tirozin yüzünden 280 nm’de ışığı emer. Bu yüzden A280 ölçümü, saflaştırılmış bir proteinin derişimini hızlıca tahmin etmenin yoludur. Protein konsantrasyonu hesaplama aracı, absorbanstan derişimi mg/mL ve µg/µL olarak verir; molekül ağırlığını girersen µM karşılığını da hesaplar.
Formül c (mg/mL) = A280 × seyreltme / (ε × l) şeklindedir. Aracın listesinde BSA (0,667), IgG (1,37), lizozim (2,63) ve ortalama protein (≈1,0) hazırdır; sana ait bir protein için özel sönüm katsayısını da yazabilirsin. Küvet yolu santimetre olarak girilir.
Örnek: Seyreltilmemiş BSA örneğinde 1 cm’lik küvette A280 = 0,8 okunsun. Derişim 0,8 / 0,667 ≈ 1,20 mg/mL çıkar. BSA’nın molekül ağırlığı yaklaşık 66,5 kDa olduğundan bu, yaklaşık 18 µM’a eşittir. Aynı absorbansı IgG için hesaplarsan değer 0,58 mg/mL’ye iner; yani yanlış ε seçmek sonucu iki katına kadar kaydırabilir.
Bu yöntem hızlıdır ve numuneyi harcamaz; ancak yalnızca saflaştırılmış, tek tür protein içeren örneklerde sağlıklı sonuç verir. Karışık lizatlarda Bradford ya da BCA gibi boya bağlayan yöntemler daha uygundur. Küvet yolu 1 cm’den farklıysa değeri mutlaka girmelisin. Aksi hâlde derişim, yol uzunluğu oranında hatalı çıkar.
Nükleik asit bulaşı A280 değerini yükseltir ve derişimi olduğundan fazla gösterir; şüphe varsa A260/A280 oranına bak. Absorbans 1,0’ı aşarsa örneği seyrelterek ölç. Yöntemin temelini hatırlamak için Beer-Lambert aracına, nükleik asit tarafı için DNA konsantrasyonu hesabına, molekül ağırlığını bulmak için DNA ve protein molekül ağırlığı aracına, stok hazırlamak için konsantrasyon dönüştürücüye bakabilirsin.