Ligasyon

Bir geni bakteriye taşımak için önce o geni bir plazmit vektörün içine yerleştirmen gerekir. Kesilmiş vektör ile eklenecek parçayı (insert) kalıcı olarak birbirine bağlayan işleme ligasyon denir. Bu işi yapan enzim çoğunlukla T4 DNA ligazdır.

Nasıl işler?

Restriksiyon enzimleri DNA'yı belirli dizilerden keser. Kesim sonucunda tek zincirli çıkıntıları olan yapışkan uçlar ya da düz küt uçlar oluşur. Uyumlu yapışkan uçlar baz eşleşmesiyle geçici olarak tutunur, ligaz da şeker-fosfat omurgasındaki boşluğu fosfodiester bağıyla kapatır. Küt uç ligasyonu daha düşük verimle gerçekleşir ve genellikle daha fazla insert ve enzim gerektirir.

Insert miktarı hesabı

Ligasyonda önemli olan kütle değil, molar orandır. Yaygın formül:

Insert (ng) = Oran × Vektör (ng) × Insert boyu (bp) / Vektör boyu (bp)

Örnek: 50 ng'lık 3.000 bp vektöre 1.000 bp'lik bir insert'i 3:1 molar oranla eklemek istiyorsan 3 × 50 × 1.000 / 3.000 = 50 ng insert kullanırsın. Çift zincirli DNA'da 1 baz çifti yaklaşık 650 dalton kabul edildiğinde vektör miktarı 50 / (3.000 × 650) × 10⁶ ≈ 25,6 fmol, insert ise yaklaşık 76,9 fmol eder.

Pratik noktalar

• Yapışkan uçlu klonlamada 1:1 ile 3:1 arası oranlar sık kullanılır; küt uçta daha yüksek oranlar denenir.
• Vektörün kendi üzerine kapanmasını önlemek için uçları fosfataz ile işlemek yaygın bir yöntemdir.
• Reaksiyon sıcaklığı ve süresi enzim üreticisinin protokolüne göre ayarlanır.

Karıştırılan kavram

Tıpta "ligasyon" ya da "ligatür" bir damarın veya kanalın bağlanması anlamında da kullanılır; tüp ligasyonu buna örnektir. Moleküler biyolojideki ligasyonla yalnızca adı ortaktır.

Gereken insert miktarını ligasyon hesaplama aracında bulabilir, DNA örneğinin derişimini DNA konsantrasyonu hesaplayıcısıyla kontrol edebilirsin.